植物组织培养超低温保存方法

2025-09-30 理论教育版权反馈

【摘要】：对植物组培材料进行超低温保存的过程大致分为4个阶段：冷冻、贮存、解冻、重新培养。为此，在冷冻材料的选择、冷冻前的预处理、冷冻保护剂的选择和使用、冷冻程序的选择等方面有一些值得注意的问题。增加对数生长期的细胞，能有效提高保存存活率。一般加入5%二甲基亚砜预培养48 h。冷冻保护剂可以防止细胞受到溶液效应的毒害。甘油、糖、糖醇类也是冷冻保护剂。该法适用于细胞含水量较低的物种或材料，如木本植物的冬芽等。

对植物组培材料进行超低温保存的过程大致分为4个阶段：冷冻、贮存、解冻、重新培养。

（一）冷冻

冷冻的原则是尽量保持细胞和组织的自然状态，同时能迅速停止各种酶的活性和细胞的各种生命活动。为此，在冷冻材料的选择、冷冻前的预处理、冷冻保护剂的选择和使用、冷冻程序的选择等方面有一些值得注意的问题。

1.冷冻材料的选择

用于冷冻的植物材料的形态和生理状态，包括物种、基因型、抗寒性、年龄、形态结构和生理状态等，都可以显著影响其在-196℃冷冻后的存活能力。一般来说，小而细胞质浓稠的分生细胞比大而高度液泡化的细胞容易成活，因为细胞质浓稠的细胞不易形成内部冰晶，高度液泡化的细胞容易产生胞内冰晶，会严重影响细胞内部结构。所以，悬浮培养的细胞和愈伤组织的细胞不适合作为保存材料。

2.冷冻前的预处理

（1）悬浮培养或继代培养。在悬浮培养中，可采用饥饿法使细胞分裂处于同步。增加对数生长期的细胞，能有效提高保存存活率。方法为：先使细胞在不含磷酸盐的培养基中饥饿4 d，后转入正常培养基中进行同步化。另外，在培养基中加入细胞分裂抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和胸腺嘧啶核苷等，使细胞滞留在G1期和S期的边界上，去除抑制剂后，细胞即达成同步化。

（2）预培养。冷冻前对材料进行短暂预培养可以提高冷冻处理后的存活率。一般加入5%二甲基亚砜（DMSO）预培养48 h。将细胞适度脱水，也可提高存活率。

（3）低温锻炼。冷冻之前，将植物茎尖置于4℃下处理3 d，可提高存活率。

（4）冷冻保护剂的选择和使用。冷冻保护剂可以防止细胞受到溶液效应的毒害。它具备以下作用：降低冰点，促进过冷却和玻璃态化的形成；提高溶液的黏滞性，阻止冰晶形成；二甲基亚砜（DMSO）可以使膜物质分子重新分布，增加细胞膜的透性，在温度降低时，加速细胞内的水流往细胞外结冰；稳定细胞内大分子的正常结构，特别是膜结构，阻止低温对膜的伤害。甘油、糖、糖醇类也是冷冻保护剂。DMSO应当在30～60 min内逐渐加入以免对细胞产生毒害作用。脯氨酸是植物体内天然的保护剂。

（二）贮存

贮存就是要求材料在液氮中长期保存，究竟能存放多长时间，目前还没有上限记录，理论上可以无限期保存。贮存期间应注意液氮的变化，一般来说只要材料能浸泡在液氮中即可，但随着时间的延长，近液氮面的温度会发生变化。如长期不加液氮或不移动液氮容器，则液氮交界处温度会升高。若温度高于-130℃，细胞内的冰晶就会生长，细胞生活力就会因此下降。(https://www.chuimin.cn)

（三）解冻

与冷冻相比，解冻相对简单，但也有些技术问题值得注意。如为了保持材料的生活力，不能像日常生活中处理冷冻食品那样，将材料放在室温下或微波炉中解冻，而是要进行一些特别的操作。解冻方法常用的有以下两种。

1.快速解冻法

把冷冻材料直接投入37℃～40℃的温水中。解冻速度为500℃～700℃/min。化冻后转入冰槽中保存。材料解冻时的再次结冰危险温度区是-50℃～-10℃，该法可以尽快越过这一温度区。

2.慢速解冻法

把冷冻材料先置于0℃下，然后逐渐升至室温，让其慢慢解冻。该法适用于细胞含水量较低的物种或材料，如木本植物的冬芽等。

解冻方法的选择不仅与材料特性有关，还与冷冻时采用的方法有关。快速冷冻的材料也应快速解冻，同时还要注意避免材料的机械损伤；一旦解冻，就应把试管转至20℃水浴中，并尽快洗涤材料并再培养，以免产生热伤害。

（四）重新培养

将解冻的材料重新置于培养基上使其恢复生长。如加了保护剂，则应当先将材料洗涤几次，以去除保护剂的毒害作用。但清洗时也会将一些冷冻过程中细胞渗漏出来的对培养有利的物质去除掉，因此有时不去除保护剂也可。

此外，在重新培养早期，一般有一个生长停滞期。它的长短取决于细胞的损伤程度、保护剂的浓度，也与植物材料和基因型有关。

植物组织培养超低温保存方法

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