实验二基因工程干扰素效价的测定1.实验目的掌握干扰素的效价测定方法。分子生物学及基因工程技术的发展为大量生产细胞因子类药物提供了条件，而对于基因工程生产的干扰素，需要进行干扰素效价的测定。本实验采用细胞病变抑制法进行干扰素效价的测定。常用于测定干扰素效价的细胞为人二倍体细胞株，如人胚肌皮细胞次代培养物、人羊膜细胞Wish、FL及人喉癌细胞Hep-2均可。基因工程干扰素样品96孔培养板、Tip。......
2023-12-07
生物技术制药实验：基因工程干扰素的制备
【摘要】：实验一基因工程干扰素的制备1.实验目的学习利用基因工程技术制备干扰素的过程。早期干扰素是用病毒诱导人白细胞产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。现在主要是利用基因工程技术构建基因工程菌、转化大肠杆菌并在大肠杆菌中发酵、表达来进行干扰素的大规模生产。构建基因工程菌①分级分离生产干扰素的白细胞中的mRNA，得到高活性的12SmRNA。
1.实验目的
学习利用基因工程技术制备干扰素的过程。
2.实验原理
干扰素（interferonIFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据其结构可分为α、β、γ、ω等4个类型。α干扰素又依其结构分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别在于个别氨基酸的差异上。早期干扰素是用病毒诱导人白细胞产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。现在主要是利用基因工程技术构建基因工程菌、转化大肠杆菌并在大肠杆菌中发酵、表达来进行干扰素的大规模生产。
3.实验试剂与材料
（1）生产干扰素的白细胞。
（2）mRNA提取分离试剂。
（3）质粒pBR322（含四环素、氨苄青霉素抗性基因）。
（4）大肠杆菌K12。
（5）阳离子交换纤维（CM32）。
（6）阴离子交换纤维素（DEAE-52）。
（7）凝胶SephadexG-100。
（8）聚乙二醇20000。
（9）蛋白质分子量标准。
（10）胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、异丙基硫代半乳糖苷、牛血清蛋白。
（11）Na2HPO4·12H2O、NH4Cl、NaCl、MgSO4、CaCl2、KH2PO4等。
4.实验仪器
蛋白质自动部分收集器、紫外核酸蛋白检测仪、梯度混合器、高效液相色谱仪、冻干机等。
5．实验步骤
（1）制备培养基
①LB液体培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、NaCl1%、氨苄西林的终浓度为60μg/ml。
②LB固体培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、NaCl1%、1.5%琼脂、氨苄西林的终浓度为60μg/ml。
③发酵培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、0.01%NH4Cl、0.05%NaCl、1.5%Na2HPO4·12H2O、1.5%KH2PO4、0.001%CaCl2、0.01%MgSO4，加少量消泡剂，pH6.8，121℃灭菌20分钟，然后冷却至37℃。
（2）构建基因工程菌
①分级分离生产干扰素的白细胞中的mRNA，得到高活性的12SmRNA。
②以此mRNA为模板合成cDNA。(www.chuimin.cn)
③将cDNA克隆到含有四环素、氨苄西林抗性基因的质粒pBR322中，转化大肠杆菌K12。
④在得到的几千个重组子克隆中筛选能产生干扰素的cDNA。
⑤最后将干扰素cDNA克隆入大肠杆菌表达载体中，转化大肠杆菌，制备基因工程菌。（3）发酵培养
①挑取基因工程菌单菌落于LB固体培养基上划线培养，37℃过夜。
②挑取单菌落于装有200mlLB液体培养基的三角瓶（500ml）中，37℃，200r/min摇床培养，至OD600约为1.0。作为种子培养液。
③向发酵培养基中加灭菌的葡萄糖（终浓度为6%）及氨苄西林（终浓度为60μg/ml），然后接入5%种子培养液，进行发酵，转速500r/min，通气量为1∶1，溶氧为50%。
④30℃发酵8小时，然后在42℃诱导2～3小时完成发酵，离心收集菌体。
（4）分离干扰素
①将离心得到的菌体用含100mmol/LNaCl的pH7.5的20mmol/L磷酸缓冲液洗涤。
②然后悬浮于5倍体积的pH7.5的20mmol/L磷酸缓冲液，冰浴超声破碎30分钟。
③4℃，10000r/min离心10分钟。
④取上清，在冰浴中搅拌，缓慢加入碾细的硫酸铵固体至85%饱和，4℃放置23小时。
⑤10000r/min离心15分钟，收集蛋白质沉淀，溶于适量去离子水中。
⑥用pH7.2的10mmol/L磷酸缓冲液透析过夜去除硫酸铵，中途至少更换3次蒸馏水。
⑦移入0.1mol/L磷酸中，于4℃透析10～12小时。
⑧用pH7.2的30mmol/L磷酸缓冲液透析至中性。
⑨4℃，10000r/min离心，去除沉淀，即得到干扰素粗液。
（5）提纯干扰素
①装CM-32阳离子交换纤维素柱，将干扰素粗液先在起始缓冲液中平衡，然后上柱，分别用含0.1mol/L，0.2mol/L，0.3mol/L，0.4mol/L，0.5mol/LNaCl的pH7.5的20mmd/L磷酸缓冲液冲洗，收集含干扰素的洗脱成分。
②装DEAE-52阴离子交换纤维素柱，将上述收集液用pH7.5的20mmd/L磷酸缓冲液平衡后，上柱，用含0.1-0.3mol/LNaCL的pH7.5的20mmd/L磷酸缓冲液洗脱，收集含干扰素的洗脱成分
③装SephadexG-100凝胶色谱柱，将上述收集液用聚乙二醇20000在4℃浓缩，上柱，用pH7.5的20mmd/L磷酸缓冲液洗脱，收集含干扰素的洗脱成分。
④干燥
（6）干扰素的检测
①总蛋白的测定：参照相关部分的实验。
②SDS-PAGE测分子质量：参照相关部分的实验。
有关生物技术制药实验的文章
- 详细阅读
-
动物卵磷脂制备实验：生物技术制药详细阅读
实验六动物药物卵磷脂制备1.实验目的学习脂类药物的制备方法。磷脂类药物在临床上应用的主要有卵磷脂及脑磷脂，二者都有增强神经组织及调节高级神经活动作用，又是血浆脂肪良好的乳化剂，有促进胆固醇及脂肪运输作用，临床上用于治疗神经衰弱及防止动脉粥样硬化。......
2023-12-07
-
红曲霉色素制备实验-生物技术制药实验七详细阅读
实验七红曲霉摇瓶发酵制备红曲霉色素1.实验目的通过红曲霉红曲色素的发酵制取过程，掌握菌种制备、培养基制备、发酵过程控制、发酵中间参数测定等微生物发酵的基本流程和技术。研究表明，产红曲色素的红曲霉代表菌株有3种，其中以紫红曲霉的红曲色素产量最高。b.红曲色素标准溶液制备准确称量1mg红曲色素标准品，用乙醇定容至10ml，于4℃低温保存。制备含填充剂红曲色素、离心、喷雾干燥成品，计算色素回收率。......
2023-12-07
-
生物技术制药实验：基因工程菌发酵详细阅读
实验一基因工程菌的发酵工艺1.实验目的了解基因工程菌发酵的一般工艺以及发酵过程的参数控制。应用基因工程技术改造的工程菌在发酵表达时，诱导起始菌浓度、诱导物浓度、诱导时间等对其也会产生影响。在火焰保护下拔下瓶塞，将菌种液小心迅速倒入发酵罐，盖上接种盖并拧紧、灭火焰，用酒精棉擦洗接种口周围。......
2023-12-07
-
糖化酶制备及活力测定-生物技术制药实验详细阅读
实验八糖化酶的制备及酶活力测定一、糖化酶的制备1.实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，由此可计算酶活力。......
2023-12-07
-
制备限制性内切酶-生物技术制药实验详细阅读
实验九限制性内切酶的制备1.实验目的了解制备限制性内切酶的一般操作过程，掌握磷酸纤维素柱色谱纯化蛋白的方法。用冰浴保持菌液温度不超过10℃。⑤外切酶的检测将有内切酶活性的洗脱液与底物长时间保温，观察电泳图谱有无变化。......
2023-12-07
-
生物技术制药实验：组织块培养技术详细阅读
实验二十九组织块培养技术1.实验目的学会组织块的培养技术，观察组织块的组织学生长行为。组织块法特别适合于组织量少的原代培养，但组织块培养时细胞生长较慢，耗时较长。注意有无污染，已贴壁的组织块边缘有无细胞“长”出。组织块的取材要尽可能快，以免组织块因取材时间过长引起细胞状态不好，将会导致后期培养。......
2023-12-07
-
免疫印迹杂交实验-生物技术制药实验详细阅读
实验十六Northern印迹杂交1.实验目的学习用标记探针杂交分析RNA样品中特定mRNA的大小及丰度。Northern印迹基本原理与Southern印迹类似，但RNA变性方法与DNA不同，不能用碱变性，否则将会引起RNA的水解。本实验以毛细管虹吸印迹法为例介绍RNA的转移过程，此方法稍加修改后也可用于Southern印迹。Northern印迹上述电泳后的凝胶一般不需进行处理即可直接进行印迹。......
2023-12-07
相关推荐