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2023-12-07
基因工程干扰素效价测定，生物技术制药实验
【摘要】：实验二基因工程干扰素效价的测定1.实验目的掌握干扰素的效价测定方法。分子生物学及基因工程技术的发展为大量生产细胞因子类药物提供了条件，而对于基因工程生产的干扰素，需要进行干扰素效价的测定。本实验采用细胞病变抑制法进行干扰素效价的测定。常用于测定干扰素效价的细胞为人二倍体细胞株，如人胚肌皮细胞次代培养物、人羊膜细胞Wish、FL及人喉癌细胞Hep-2均可。基因工程干扰素样品96孔培养板、Tip。
1.实验目的
掌握干扰素的效价测定方法。
2.实验原理
干扰素是一组由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子、具有多种生物学功能的活性蛋白质。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、调节细胞生长和分化、调节免疫功能等多种生物活性。分子生物学及基因工程技术的发展为大量生产细胞因子类药物提供了条件，而对于基因工程生产的干扰素，需要进行干扰素效价的测定。
本实验采用细胞病变抑制法进行干扰素效价的测定。常用于测定干扰素效价的细胞为人二倍体细胞株，如人胚肌皮细胞次代培养物、人羊膜细胞Wish、FL及人喉癌细胞Hep-2均可。通常采用Wish细胞/VSV体系来测定。VSV为水泡性口腔炎病毒，可使Wish细胞产生细胞病变（cytopathiceffect，CPE），用干扰素预先处理Wish细胞，可使细胞免受VSV攻击病毒的破坏。活细胞能吸收一定的染料，吸收染料的量与活细胞数成正比，因此脱色后测定上清A值，再根据量反应平行原理，以国家标准品为对照参考，经比较计算，即可得到干扰素的效价。
3.实验试剂及材料
（1）MEM培养基、小牛血清。
（2）消化液：取0.2g乙二胺四乙酸二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.152g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，用蒸馏水配成1000mL的溶液，121℃、高压灭菌15分钟。
（3）染色液：取50mg结晶紫加入20mL乙醇溶解，用蒸馏水定容到100mL。
（4）脱色液：50%乙醇，50%蒸馏水，0.1%乙酸（v/v）。
（5）PBS：取8g氯化钠，0.2g氯化钾，1.44g磷酸氢二钠，0.24g磷酸二氢钾，用蒸馏水配成1000mL溶液，121℃、高压灭菌15分钟。
（6）Wish细胞：用含10%小牛血清的MEM培养基培养，呈单层贴壁生长，每周按1∶4消化传代两次。
（7）水泡性口腔炎病毒VSV：于-70℃保存。
（8）干扰素效价测定用标准品。
（9）基因工程干扰素样品
（10）96孔培养板、Tip。
4.实验仪器(www.chuimin.cn)
CO2培养箱、分光光度计、微量移液器。
5.实验步骤
以下（1）~（5）各步骤在无菌条件下进行。
（1）干扰素标准溶液及样品溶液制备
取1支干扰素标准品，按说明书溶解后，用测定培养液稀释至103U/ml。待检样品溶解后，同样用测定培养液稀释至于103U/ml。
（2）病毒液制备
取保存的VSV用含3%小牛血清MEM培养基稀释到工作浓度，一般以100TCID50为攻毒剂量。
（3）对数生长期的Wish细胞，经PBS洗涤、消化液消化、收集细胞，用含10%小牛血清的MEM培养基配成浓度为3.5×105/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5%CO2条件下培养4～6小时。
（4）在96孔细胞培养板的第6、7列加入干扰素标准溶液，其两侧加入干扰素样品，每个待检样品做2个复孔，自A行到H行作4倍系列稀释，每孔加液100μl，样品及标准品的稀释用含7%小牛血清的MEM培养液，37℃、5%CO2条件下培养18～24小时。
（5）弃上清，加入病毒液，每孔100μl，37℃、5%CO2培养24小时。
（6）弃上清，每孔加入50μl染色液，室温放置30分钟。
（7）流水小心冲去染色液，滤纸吸干残留水分，然后每孔加入100μl脱色液，室温放置3~5分钟。
（8）测定每孔A570值，参比波长630nm，记录测定结果。
6.结果分析
采用直线回归计算法进行处理。分别计算各试验样品的半效稀释倍数（即从样品溶液至相当于标准品50%最大效应点的稀释倍数），并按下式计算试验结果：
待检样品效价=标准品效价×
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