食品酶学导论：固定化酶特性及影响因素

2023-11-22 理论教育版权反馈

【摘要】：固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。固定化酶在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收反复利用。使用载体结合法制成的固定化酶的Km有时发生变化，主要是由于载体与底物间的静电相互作用。从两者比较还可以看出，固定化酶pH曲线比较平缓，也就是固定化酶受缓冲液的影响较小，载体对酶起保护作用。

通常情况下，游离酶的性质不稳定，不仅常受环境酸碱度影响而且还对温度较为敏感，在不利条件下活性降低甚至失去活性；并且游离态酶通常不能重复利用，难于自动化，这大大加深了游离态酶在环境污染治理中实际应用的难度。针对以上实际应用中常见问题，20世纪60年代出现了酶固定化技术，并迅速发展。酶的固定化技术不仅增加酶对极端条件的耐受性，并且增大可回收性和重复使用概率，这些优势使得固定化酶更适合治理实际生活中的农药污染问题。

1.固定化酶的性状

固定化酶的形式多样，依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。其中颗粒占绝大多数，它和线条这两种形式主要用于工业发酵生产，如装成酶柱用于连续生产，或在反应器中进行批式搅拌反应；薄膜主要用于酶电极，应用于分析化学中；酶管机械强度较大，宜用于工业生产。

2.酶活力

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的转化速率来表示，即酶催化的转化速率越快，酶的活力就越高；反之，速率越慢，酶的活力就越低。所以，测定酶的活力就是测定酶促转化速率。酶转化速率可以用单位时间内单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。酶活力的测定既可以通过定量测定酶反应的产物或底物数量随反应时间的变化，也可以通过定量测定酶反应底物中某一性质的变化，如黏度变化来测定。通常是在酶的最适pH和离子强度以及指定的温度下测定酶活力。固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。固定化酶由于与反应底物接触面减小，所以催化效率有所降低。

固定化酶在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收反复利用。与游离酶相比，固定化酶可以在较长时间内反复利用，反应过程可以严格控制，有助于提高酶的稳定性，酶易于与底物和产物分开，增加产物的收率，提高产物的质量，使酶的使用效率提高，成本降低。

一般采用测定酶促反应初速度的方法来测定活力，因为此时干扰因素较少，速度保持恒定。反应速度的单位是浓度/单位时间，可用底物减少或产物增加的量来表示。因为产物浓度从无到有，变化较大，而底物往往过量，其变化不易测准，所以多用产物来测定。

3.固定化酶稳定性

（1）操作稳定性提高固定化后酶稳定性提高的原因：①固定化后酶分子与载体多点连接；②酶活力的释放是缓慢的；③抑制自降解，提高了酶稳定性。

（2）贮藏稳定性比游离酶大多数提高。

（3）对热稳定性，多数升高，有些反而降低。

（4）对分解酶如蛋白酶的稳定性提高。

（5）对变性剂的耐受力升高。

（6）酸碱稳定性固定化酶pH的变化：①载体的形质对固定化酶作用的最适pH有明显的影响：载体带负电荷，最适pH比游离酶的最适pH高（向碱性方向移动）；载体带正电荷，最适pH比游离酶的最适pH低（向酸性方向移动）；载体带不带电荷，最适pH一般不改变（有时也会有所改变，但不是由于载体的带电性质所引起的）。

②产物性质对pH的影响：催化反应的产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶的pH高；催化反应的产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶的pH低；催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH比游离酶的pH不变。

4.固定化酶反应特性

固定化酶的底物专一性、反应的最适pH、反应的最适温度、动力学参数、最大反应速度等均与游离酶有所不同。

（1）底物专一性游离酶经固定化，由于空间位阻的影响，酶对高分子底物的活性显著减小。

（2）反应的最适pH最适pH和pH曲线的变动取决于酶蛋白和水不溶性载体的电荷性质。有些酶在固定化后最适pH发生变化，而pH曲线不变。

（3）反应的最适温度固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，但也有不变甚至降低的。

（4）米氏常数K_m米氏常数K_m表明了酶与底物的亲和力。固定化酶的K_m与游离酶的K_m有差异。使用载体结合法制成的固定化酶的K_m有时发生变化，主要是由于载体与底物间的静电相互作用。

（5）最大反应速度v_max固定化酶的最大反应速度v_max与游离酶多数是相同的。

举例：固定化蔗果寡糖酶的特性

蔗果低寡糖是一种由2～4个果糖和1个葡萄糖由 α-1，2糖苷键结合而成的低聚糖，在洋葱、香蕉、大蒜、西红柿和牛蒡等食品中含量丰富，现在已经采用微生物发酵法首先生产果糖苷转移酶（Fructosyltransferase）或呋喃果糖苷酶（Fructofuranosidase），然后以蔗糖为原料（底物）利用该酶催化生成混合糖浆。1984年日本明治制果公司首先推出含蔗果寡糖55%的液状制品和含95%蔗果寡糖粉状颗粒制品，由于这些新型糖类不被人体唾液酶以及小肠消化酶所水解，正常人摄取该糖后，检测其血糖值，胰岛素均未上升，高血脂患者连续2～4周每天摄取该糖8g的食品，胆固醇、中性脂肪和血糖值降低，故适于糖尿病患者食用。医学界研究指出，每天摄入8g蔗果寡糖，大肠内有益菌双歧杆菌可增殖10倍，有益于健康，因此，蔗果寡糖是一种重要的“双歧因子”。

华南理工大学生物科学与工程研究中心对蔗果寡糖酶的特性及固定化作过系统研究，对该酶固定化特性研究结果如下。

（1）最佳pH反应体系：磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在pH为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0时分别取这些缓冲液9.2mL，0.6g/mL蔗糖溶液30mL，酶珠2.5g，在55℃反应1h。

从图8-6可知酶活力下降，这是因为当酶与载体相结合时，它的结构起了变化，另外酶被结合后，虽不失活，但酶与底物的相互作用受到空间位阻和扩散限制的影响。最适pH在5.0～5.5。从两者比较还可以看出，固定化酶pH曲线比较平缓，也就是固定化酶受缓冲液的影响较小，载体对酶起保护作用。

图8-6 pH对酶活力的影响

（2）pH的稳定性将酶液与不同pH的缓冲液（pH3～8磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH8.6～10.6甘氨酸-氢氧化钠缓冲液），45℃水浴保温1h后，测其酶活力，以未保温处理的酶活力为100%，在最适条件下，测定残余酶活，然后折合成剩余酶活力的百分数，以此对pH作图，图8-7是pH稳定性曲线，温度为30℃，保温时间是1h。

由此可见该酶在pH4.6～8.0范围内比较稳定。氢离子在溶液和固定化酶之间的分配效应，对反应速度具有重要影响，如果酶反应产生或消耗酸，又会出现另一些反应。在低底物浓度下，速度随pH改变取决于游离酶的pK值；在高底物浓度下，则取决于酶-底物络合物的电离作用。

（3）温度对酶活的影响在pH5.5条件下，取酶液分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃水浴中测酶活力，与游离酶相比，其最适温度有一定程度的提高，约为58℃，适宜范围在40～70℃，这是载体对酶有保护作用的实验证据之一（图8-8）。

图8-7 pH稳定性曲线

图8-8 温度对酶活力的影响

（4）米氏常数采用Lineweaver-Burk法测定固定化酶活力的表观动力学常数，在最适条件下（海藻酸钠∶酶液=2.5∶1、55℃、pH5.5），配制不同浓度的蔗糖溶液，在最适条件反应1h后，测定产物含量，计算反应速度。

其中v为反应速度，在单位时间内因转移反应生成葡萄糖，单位为mg/（L·min）。v_max为最大反应速度，[S]为底物浓度，单位为mg/L。以每一个1/v对应1/[S]作图，由此求取v_max和K_m。y轴截距为1/v_max，x轴截距为-1/K_m，求得K_m、最大反应速度v_max。固定化酶的回归方程为：(www.chuimin.cn)

y=5.690x+0.5134

相关系数r=0.9999

当x=0，y=1/v_max，v_max=3.670[mg/（L· min）]，K_m=4.297（mg/L）。

由图8-9表明，固定化酶米氏常数上升是由于固定化酶附近微环境的溶液浓度小于主体溶液浓度，另外，扩散阻力也会使K_m增大，K_m倒数表示酶和底物的亲和力的大小，由于固定化酶载体扩散阻力使得亲和力减小，不利于反应的进行。

（5）稳定性载体的结构会影响到基团的分布状况和微环境。同样，载体的活性基团也可能使固定化酶在构象上有所差异。酶经固定化后，在一般情况下，稳定性问题是关系到固定化酶能否实际应用的问题。

①热稳定性：固定化酶在不同温度下保温1h，在55℃测其酶活，将适量固定化酶加入35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃和70℃的不含底物的6个试管中，保温，迅速冷却后加入底物，在55℃测残余酶活力，游离酶按同一方法保温，测定残余酶活力，结果如图8-10所示。试验结果表明固定化酶的热稳定性较游离酶有很大提高，这是由于载体为酶蛋白提供的微环境，更近似于酶的天然条件，起保护作用，并且固定化酶的构象比游离酶稳定。

图8-10 固定化酶的热稳定性

55℃下保温不同时间进行酶活力测定，55℃下，将固定化酶加入不含底物的反应体系中，加热不同时间，取出迅速冷却，加入蔗糖底物，在55℃下测残余酶活力，和最初未加热处理的酶活力相比，得出相对残余酶活力比率（%）（图8-10）。

从图8-10可知，固定化酶在55℃保温不同时间，酶活力有一些下降，当保温48h后残存酶活为原来的67%。

②贮藏稳定性：固定化酶在操作中可以长时间保存活力，半衰期在一个月以上，有工业应用价值。

固定化酶制成后，最好立即使用，如长期贮藏，活力不免下降，但贮藏得法，也可较长时间保持活力。

半衰期原本指放射性原子核数衰减到原来数目一半时所需的时间，这里指酶活下降一半所需时间。固定化酶2～3℃下保存半衰期可以用来说明其储藏。

其中N₀可作为t时间前的酶活力（即E₀），N可作为经过t时间后的酶活力（即E_t），而半衰期t₁₂可用式（8-3）计算：

例如，对于固定化酶：刚制备时酶活E₀=73.6，一个月后酶活E_t=66.16，则：

而对于游离酶：刚制备时酶活E₀=94.78，一个月后酶活E_t=70.12，则：

可见，固定化酶的贮藏稳定性比液体酶好，可以长时间贮藏。但尽管如此，制好的固定化酶在不用时，最好放入冰箱保存。

③操作稳定性：操作稳定性除了和本身特性有关外，还受其他一些条件的影响，如批式搅拌反应有机械损伤和器壁效应，所以操作稳定性不如柱反应器。

用制备好的固定化酶，反应生产12批蔗果低聚糖，每批固定化酶10g，0.6g/mL蔗糖溶液30mL，pH5.5马尔文缓冲液（Mallvain buffer）缓冲液9.2mL，在55℃反应24h。结果如图8-11所示。葡萄糖浓度保持在40.10%～44.20%，果糖在20.90%～22.30%，蔗糖在18.00%～24.00%，蔗果三糖11.24%～13.20%，蔗果四糖在2.36%～3.40%。随着反应时间的延长，蔗糖和果糖在逐渐增加，这和蔗果糖酶的酶活力减少有关，蔗果糖酶的转移酶活力减少，所以果糖的量在增加。葡萄糖、蔗果三糖和蔗果四糖的产量在下降，这是因为蔗果糖酶的水解酶活力和转移酶活力均下降所致。

图8-11 固定化酶操作稳定性

从图8-11可以看出，固定化酶连续生产12批产物，历时24d，产量减少不多，这进一步说明固定化酶的操作稳定性较高。

④对蛋白酶的稳定性：游离酶经固定化后，对蛋白酶的抵抗力提高了，这可能因为蛋白酶是大分子，受到空间位阻，不能进入固定化酶中。

1.酶本身

酶本身的变化，主要是由于活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生了变化，分子构象的改变会影响固定化酶的性质。

2.载体

载体可分为以下3类：

（1）天然有机物许多天然有机物都可作为固定化酶的载体，主要是一些不溶于水的多糖类载体，如纤维素、淀粉、琼脂糖、壳聚糖和海藻酸等。这些载体最大的优点是无毒性、性能温和、亲水性能强、容易改性、材料来源广、成本低等。

（2）合成有机物合成高分子材料是固定化酶技术中具有发展前景的材料之一，它们的结构和性能可以人为的调节和控制，从而满足不同酶的固定化以及酶催化反应的需求。合成高分子材料相比于天然有机物，它们自身抗微生物的防腐性能更佳，机械强度也得到了提升。

（3）无机固体无机载体相比于有机载体机械强度更高，热稳定性好，不易分解。常用的无机载体主要有玻璃、金属、氧化铝、膨润土、二氧化硅等。