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2023-10-28
3.3.1.1 邻二氮菲法测定低次烟叶多糖清除OH自由基的能力
取10mL试管12支,试验组10支中分别加入磷酸缓冲液1mL,7.5mmol/L的1,10-二氮杂菲溶液1mL,3.25mmol/L FeSO4溶液1mL,1.5%H2O21mL,以及不同浓度的多糖溶液各2mL。调零组以蒸馏水代替多糖溶液;对照组以蒸馏水代替多糖溶液和1.5%H2O2。充分混匀后37℃恒温放置1h,用调零组调零,在510nm波长下测定各组的吸光度值。每个试管至少平行3次,取其平均值,如式(3-1)所示。
式中 Ai——试验组的吸光度值;
Aj——对照组的吸光度值。
3.3.1.2 DPPH法检测低次烟叶多糖清除·DPPH的能力
三支试管分别加入:①2mL多糖溶液与2mL 0.1g/L的·DPPH 50%乙醇溶液,②2mL 0.1g/L的·DPPH 50%乙醇溶液与2mL蒸馏水,③2mL多糖溶液及2mL 50%乙醇,于25℃放置1h,以50%乙醇溶液为空白在517nm波长下测定其吸光度。①号试管测得Ai,②号试管测得A0,③号试管测得Aj。
计算粗多糖对·DPPH的清除率,如式(3-2)所示。(www.chuimin.cn)
3.3.1.3 ABTS法测定低次烟叶多糖的总抗氧化能力
ABTS溶液和氧化剂溶液按1∶1的比例混匀,即ABTS工作母液,室温避光存放12~16h后备用。用pH为7.2的磷酸缓冲液将ABTS工作母液稀释100倍,即为ABTS工作液。于96孔板的检测孔中,分别加入20μL ABTS工作液。然后,于样品检测孔内各加入10μL不同浓度的多糖样品,空白对照孔中加入10μL蒸馏水pH7.2的磷酸缓冲液;标准曲线检测孔内各加入10μL不同浓度的Trolox标准溶液,轻轻混匀。于超微量分光光度计上,室温孵育2~6min,测定734nm处的吸光度A734,根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。
以标准品Trolox的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线得回归方程:y=-0.3313x+0.2498,R2=0.9946。
所得结果如图3-7所示。由试验结果可以得出,低次烟叶多糖在较低浓度的时候就会产生清除羟基自由基的活性。随着浓度的增高,清除羟基自由基的能力进一步加强,当浓度为4mg/mL时,低次烟叶多糖的羟基自由基的清除率已经达到54.8%,当浓度为10mg/mL时为69.4%,如图3-7(1)所示。在DPPH自由基清除试验中,低次烟叶多糖对DPPH自由基的清除效率在一定的浓度范围内和多糖浓度呈一定的量效关系,即随着低次烟叶多糖浓度的增加,低次烟叶多糖对DPPH自由基的清除率也逐步增加。当浓度为0.9mg/mL时清除率达到80.81%,如图3-7(2)所示。而在ABTS法试验中,在低次烟叶多糖浓度为6mg/mL时,其清除ABTS自由基的能力与0.617mmol/L Trolox相等,如图3-7(3)所示。以上结果表明,低次烟叶多糖具有较好的自由基清除能力,是一种很好的抗氧物质,这为低次烟叶的潜在使用价值提供了一定理论基础。
图3-7 低次烟叶多糖抗氧化性能效应图
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2023-10-28
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2023-10-28
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