金属基电化学核酸杂交指示剂的研究进展

2023-06-22 理论教育版权反馈

【摘要】：近年来，金属配合物因在化学核酸酶、电化学发光标记和结构探针等方面的广阔应用前景而作为一种优秀的DNA靶向分子成为无机生物化学领域研究的一个热点[86]。因此，对简单多吡啶配合物的配体进行有目的的修饰和衍生，从而提高其作为电化学DNA杂交指示剂的灵敏度和降低背景信号的干扰成为目前开发优秀杂交指示剂的研究需要。当将[Os3]2+作为电化学杂交指示剂应用于对目标DNA的定量检测时，还原峰电流在6.9×10-10g/mL-6.9×10-5g/mL范围内呈现良好的线性关系。

近年来，金属配合物因在化学核酸酶、电化学发光标记和结构探针等方面的广阔应用前景而作为一种优秀的DNA靶向分子成为无机生物化学领域研究的一个热点[86]。因配合物具有许多光学、电学等优良特性，目前作为一类对ssDNA和dsDNA具有识别能力的小分子也越来越受到重视。

（1）简单多吡啶类配合物

简单多吡啶类配合物是一类含有简单联吡啶（bpy）或邻菲罗啉（phen）等具有较小平面芳性结构的配体，以过度金属离子钴（Co）、铁（Fe）、锇（Os）、钌（Ru）等为中心离子的金属配合物。虽然这类配合物的结构比较简单，但却由于合成方便、耗时短、指示效果明显等优点而在DNA杂交检测中被广泛应用。

Wang等[39]采用计时电位滴定法研究了艾滋病病毒片段DNA与三邻菲罗啉合钴 pagenumber_ebook=16,pagenumber_book=12 之间的相互作用，并对探针固定、杂交时间、指示剂结合时间等实验条件进行了优化，结果表明，当杂交反应为30 min时，杂交效率最高，而且以为杂交指示剂对艾滋病病毒相关的基因片段进行检测时，检测限可以达到4×10-9 mol/L。Motonaka等[40]将DNA固定在碳糊电极，然后研究了不同修饰电极与三联吡啶合锇 pagenumber_ebook=16,pagenumber_book=12 之间的相互作用，结果发现该锇配合物与单链DNA和双链DNA具有不同结合力，且与双链DNA能产生特异性的作用。Yan等[41]采用循环伏安法研究了三联吡啶合钌与小囊性腺瘤spp基因片段相关的DNA之间的作用，结果表明，使用 pagenumber_ebook=16,pagenumber_book=12 作为杂交指示剂能在1.8×10-10mol/L～9.0×10-8mol/L范围内实现对目标物的定量检测，检测限为9.0×10-11mol/L。

（2）功能修饰多吡啶类配合物

尽管简单多吡啶配合物具有合成方法简单等优点且广泛应用于DNA杂交检测中，但是我们也应该看到它们自身结构的特点所带来的不足，比如，联吡啶配体的芳环共轭平面结构较小、与dsDNA的嵌插力比较弱，导致在处理过程（淋洗）中容易脱落；中心金属离子的氧化还原电位普遍偏高，给电化学测定带来了很多不必要的麻烦；另外，由于该类配合物与dsDNA存在较弱的嵌插作用使其与dsDNA和ssDNA均存在不同程度的的静电作用，降低了对目标物检测的信噪比和选择性。因此，对简单多吡啶配合物的配体进行有目的的修饰和衍生，从而提高其作为电化学DNA杂交指示剂的灵敏度和降低背景信号的干扰成为目前开发优秀杂交指示剂的研究需要。

Maruyama等[42]用5，6位含取代甲基的phen配体（5，6-dmphen）和4，7位含取代甲基的phen配体（4，7-dmphen）与锇元素配位形成三5，6二甲基邻菲罗啉合锇[Os（5，6-dmphen）3]2+（图1.2.7）和三4，7二甲基邻菲罗啉合锇[Os（4，7-dmphen）3]2+，然后采用循环伏安法和微分脉冲伏安方法研究了其与小牛胸腺DNA之间的结合能力以及与ssDNA、dsDNA作用的选择性，并且将这种差异与[Os（bpy）3]2+和[Os（phen）3]2+进行了对比。结果表明，[Os（5，6-dmphen）3]2+较其他配合物具有更强的dsDNA结合作用力（4.2 L/mol×105L/mol）和选择性。当将[Os（5，6-dmphen）3]2+作为电化学杂交指示剂应用于对目标DNA的定量检测时，还原峰电流在6.9×10-10g/mL-6.9×10-5g/mL范围内呈现良好的线性关系。

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图1.2.7　[Os（5，6-dmphen）3]2+的分子结构式[42]

Maruyama等[43]还合成了一种氨基吡啶配体（DAbpy）的Os配合物[Os（DA-bpy）2DPPZ]2+（DPPZ=二吡啶并[3，2-a，2'，3'-c]吩嗪）（图1.2.8）。在DNA传感实验中发现，由于DA-bpy配体中含有富电子基团-NH2，能够有效地控制该锇配合物的中心金属原子的氧化还原电位及插入配体DPPZ与DNA之间的结合能力。当将[Os（DA-bpy）2DPPZ]2+作为杂交指示剂应用于目标DNA的定量检测时，结果显示该锇配合物的电化学信号与互补链DNA浓度在1.0 pg/mL-0.12 μg/mL呈良好的线性关系，检测限为0.1 pg/mL。

Liu等[44，45]将含有5，6二甲基-1，10-邻菲罗啉（5，6-dmphen）和联吡啶（bpy）配体的多吡啶锇配合物[Os（5，6-dmphen）2Cl2]和[Os（bpy）2Cl2]的单体与高分子聚合物聚乙烯吡啶（PVP）进行嫁接，合成了新型的聚合物型杂交指示剂PVP-[Os（5，6-dmphen）2Cl]2+（图1.2.9A）和PVP-[Os（bpy）2Cl]2+（图1.2.9B），采用微分脉冲伏安法分别研究了这两种配合物与DNA的相互作用，结果显示该指示剂的灵敏度较其单体[Os（5，6-dmphen）3]2+提高了1000倍，检测限达到0.5 amol，这可能是因为当聚合物中的一个单体与DNA发生嵌插作用后，能通过聚合链来增加可被电化学检测的信号分子数，从而提高了杂交指示剂的灵敏度。此外，PVP-[Os（5，6-dmphen）2Cl]2+配合物的氧化还原电位出现在+360 mV（vs Ag/AgCl），较其单体负移了＞300 mV，很好的保护了DNA探针在电极表面由于电位过高或过低而出现的损伤或脱落等缺点。

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图1.2.8　[Os（DA-bpy）2DPPZ]2+的分子结构式[43]

（3）螺纹型配合物

螺纹型配合物是一类比较重要的DNA杂交嵌入剂，其原因在于这些配合物能与dsDNA发生可逆性的结合。而且这类配合物都具有一个共同的结构特征，即在配合物的两端含有氧化还原能力的配合物单体，而在中心则是一个大的芳性共平面芳环结构。当芳环平面结构单元与双链DNA碱基对发生疏水性嵌插作用时，两端的修饰基团会同时结合到DNA的大沟槽和小沟槽区内部，从而有效能有效的提高配合物与DNA结合力的大小[46]。

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图1.2.9　PVP-[Os（5，6-dmphen）2Cl]2+（A）和PVP-[Os（bpy）2Cl]2+（B）的分子结构式[44，45]

Tansil等[47]以1，4，5，8-萘二亚胺（PIND）共轭平面结构为母体，在其两端修饰上具有电化学活性的带正电荷的联吡啶锇配合物[Os（bpy）2Cl2]单体，合成了一种新型的螺纹型嵌插剂PIND-[Os（bpy）2Cl]+（图1.2.10），并采用凝胶电泳法和循环伏安法研究了该配合物与DNA之间的相互作用。实验结果显示，该配合物与双链DNA的结合力明显强于其母体PIND。在PIND-[Os（bpy）2Cl]+与DNA发生作用时，根据实验结果我们推测，PIND基团以一种典型的螺纹嵌插模式与dsDNA发生结合，同时，两个带正电荷的Os（bpy）2Cl+则通过静电作用与DNA相互作用，进一步促进了PIND母体部分嵌入到DNA双螺旋结构内部。电化学杂交传感分析实验结果表明，在最佳条件下，使用PIND-[Os（bpy）2Cl]+作为DNA杂交指示剂比直接测量DNA杂交的灵敏度高了2500倍，而且对50 bp目标DNA序列的定量检测范围为1.0-300 pmol/L，检测限达到了600 fmol/L，表明以PIND-[Os（bpy）2Cl]+为指示剂构建的传感器具有很好的分析性能。

（4）其他金属配合物

另外还有一些其他类型的金属配合物，由于对ssDNA和dsDNA也具有一定的选择性结合能力而被应用于DNA杂交的电化学检测。比如，我们常用与电化学标记的具有很好的氧化还原电信号和生物相容性的二茂铁，由于具有二个可以自由旋转的环戊二烯环，能与双链DNA碱基产生疏水作用和堆积作用而发生沟面结合，但是与单链DNA却不能发生作用，基于此特征，也经常被作为电化学DNA杂交传感器的指示剂[48]。

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图1.2.10　PIND-[Os（bpy）2Cl]+的分子结构式[47]

金属基电化学核酸杂交指示剂的研究进展

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