逆境胁迫激活的Ty3-gypsy类反转录转座子及其关系

逆境胁迫激活的Ty3－gypsy类反转录转座子的关系

徐　玲　陈自宏

摘　要:水稻LTR类反转录转座子具有较高活性，其中Ty3－gypsy类的比重较大。以Ty3－gypsy类RT保守区域的简并引物，利用RT－PCR的方法从5种逆境处理后水稻的cDNA中克隆测序了一批反转录酶(RT)片段，分析了不同逆境诱导激活的Ty3－gypsy类反转录转座子的关系。结果显示，5种逆境处理都能激活水稻Ty3－gypsy类反转录转座子的表达;大部分具活性的Ty3－gypsy类反转录转座子同源性较高，不同逆境激活的反转录转座子序列可以具有很高的同源性，而同一逆境处理激活的反转录转座子序列也可以存在较高异质性。

关键词:水稻　Ty3－gypsy类反转录转座子　逆境胁迫　活性　同源性

一、引　言

反转录转座子是水稻基因组中最丰富的转座因子，其中LTR元件的组成成分最高。水稻LTR元件中gypsy类元件的比重又要远大于copia类，其数量为copia类的4～5倍，平均长度也为copia类的2倍。

本文意图以Ty3－gypsy类反转录转座子来探明不同逆境胁迫激活的反转录转座子的关系。根据Ty3－gypsy类反转录转座子反转录酶(Reverse Transcriptase，RT)保守序列的特征，采用简并引物通过RT－PCR从不同逆境处理下水稻品种月亮谷的cDNA中扩增了一批RT片断，并进行克隆测序后进行序列比较分析。

二、材料和方法

(一)实验材料

水稻幼苗;稻瘟菌(M. grisea)菌株。

(二)研究方法

1.逆境诱导处理

在温室培育至3～4叶期的水稻幼苗，分别用稻瘟菌的孢子悬浮液(10⁵个/mL)、SA(2mM)和2，4－D(50mM)喷雾接种和高盐溶液灌溉(100mM NaCl)四种方式处理，保温保湿24h。处理24h后，用无菌剪刀剪取水稻叶片，液氮速冻后迅速置于－80℃冰箱中备用。

水稻液体悬浮培养3month(M)后的细胞，去培养液后用无菌水洗两次，在吸水纸上吸干水分，液氮速冻后迅速置于－80℃冰箱中备用。

2.水稻叶片总RNA的提取及cDNA第一链的合成

各种逆境处理的水稻材料采用TRNzol试剂抽提方法提取水稻总RNA。实验中所用器皿均经过烘烤、0.1% DEPC水处理以去除RNase。用RNase－Free DNase酶解去除RNA中残留的DNA，置－80℃保存待用。并用北京全氏金生物公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链，获得的cDNA立即置冰上冷却，－20℃冻存。

3.Ty3类转座子的克隆测序

根据Ty3－gypsy类反转录转座子的反转录酶保守序列特征，采用Kumekawa等(1999)针对Ty3－gypsy类反转录转座子RT序列设计的简并引物(见下表)。

Ty3－gypsy类反转录转座子RT片断的简并引物

f: Forward primer; r: Reverse primer.

PCR反应体系为100μL: 50μL 2×EasyTaq PCR Supermix，5μL正向引物(10μmol/L)，5μL反向引物(10μmol/L)，cDNA模板5μL，水的体积共35μL。扩增程序为: 95℃预变性3min。35个循环包括: 95℃40sec，56℃50 sec，72℃50 sec。循环后72℃延伸10min。

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收并连接到pEASY－T1载体上，转化到感受态大肠杆菌DH5α中。菌落PCR验证的阳性单克隆送到上海英骏生物技术有限公司进行测序。每种逆境诱导条件得到的阳性克隆选取15～20个进行测序。

4.序列比较

测序结果除去引物两端多余序列后则为扩增到的目的序列，与GenBank中的序列用BLAST(http://www．ncbi．nlm．nih．gov/)进行比较验证序列的真实性并获得序列的登录号。

三、结果分析

(一)克隆逆境诱导转录的Ty3类反转录转座子的RT片段

用RT酶基因的简并引物，从5种不同逆境处理水稻材料的cDNA中均能扩增获得期望的430bp左右的带(见图1)，说明几种逆境处理都能诱导激活水稻Ty3－gypsy类反转录转座子的表达。

M: DL2000 Marker; 1:组织培养胁迫; 2:稻瘟菌胁迫; 3: SA胁迫; 4: 2，4－D胁迫; 5:盐胁迫;未作处理的对照。图1逆境诱导转录的Ty3－gypsy类RT片断的PCR扩增

将扩增产物回收并克隆到pEASY－T1载体上，得到一批阳性克隆，每种逆境处理得到的克隆随机挑取15～20个进行测序。测序得到的序列除去引物两端的多余序列则为扩增到的目的序列。以Osgyrt为前缀进行命名，分别命名为Osgyrt－tc(tissue culture stress)、Osgyrt－Mg(M. grisea stress)、Osgyrt－SA(SA stress)、Osgyrt－D(2，4－D stress)、Osgyrt－St(salt stress)。

(二)转录的Ty3类反转录转座子RT片段的序列比对和系统进化分析(www.chuimin.cn)

共获得70条独立的序列: Osgyrt－tc1～16，Osgyrt－Mg1～17，Osgyrt－SA1～12，Osgyrt－D1～14，Osgyrt－St1～11。将所有序列在GenBank中用BLAST进行比较，结果表明，所有序列与GenBank中已上传的反转录转座子RT序列同源性都很高(＞94%)，说明克隆到的反转录转座子的真实性。将这些核酸序列翻译为氨基酸序列后进行序列比对，大部分RT氨基酸序列间的同源性都很高，只有少数存在较高异质性，说明大部分具活性的Ty3－gypsy类反转录转座子同源性较高(图2)。

不同逆境形成的RT序列大部分都具有高同源性，呈交叉分布。很多不同逆境诱导转录的RT序列同源性都高于同一逆境诱导转录的RT序列。第1组中包含了5种不同逆境诱导转录的大部分RT序列，同源性较高，在90%以上(图2A);而同一逆境胁迫，如M. grisea stress得到的活性RT序列在第1与第6组中差异最大的相似性仅为36%(图2B)，可见同一逆境处理激活的反转录转座子序列也存在较高异质性，而不同逆境激活的反转录转座子序列可以具有很高的同源性。

图中四种不同程度的阴影部分表示氨基酸同源性:黑色部分为＞100%，深灰色部分为＞80%，浅灰色部分为＞60%，没有阴影部分为＜60%。

图2　不同逆境激活的Ty3－gypsy类RT氨基酸的序列比对

四、讨论

不同物种同一类型的反转录转座子保守性较强，有些序列在种属间的差异小于种内差异。Voytas等(1992)发现动物、植物、微生物的反转录转座子RT序列平均相似性达46%。基于植物反转录转座子RT区域的高度保守片段，用PCR方法已在多种植物中扩增出反转录转座子。我们基于植物Ty3－gypsy类反转录转座子RT区域的高保守性来扩增克隆逆境胁迫转录的RT序列。

稻瘟菌、SA、2，4－D、高盐、组织培养等多种逆境胁迫都能激活Ty3－gypsy类反转录转座子的转录表达。近年来关于反转录转座子被多种逆境胁迫激活的报道很多，如烟草中Tnt1和Tto1在微生物诱导因子，病原菌侵染，组织培养，SA、JA、伤害诱导等压力条件下都具有转录活性;稻瘟菌中MAGGY被热击、CuSO₄、氧化压力所激活。这些发现将不断地揭示反转录转座子的转录机制及其在植物进化过程中的作用。

逆境诱导反转录转座子激活的机制和生物学意义目前尚不清楚。但很多研究认为反转录转座子在植物适应环境压力中担当了重要角色。Beguiristain等(2001)认为反转录转座子通过进化获得与寄主逆境诱导基因启动子相似的启动子，从而在逆境条件下得以表达。胡志昂等(2007)推测，逆境诱导反转录转座子的活性影响转录因子的表达，改变一系列抗性基因的表达水平。但反转录转座子激活究竟是植物抗病的起因还是抗病的结果目前尚未定论，也就是说反转录转座子高水平定点激活有可能是导致植物定点防御反应的起因之一，也有可能是植物进行抗病反应时的干扰激活了反转录转座子。反转录转座子在环境胁迫下的激活为植物在多样性环境下的生存提供了一种基因组的可塑性机制。从本研究中反转录转座子对多种逆境胁迫的应答，我们可以推断它们在逆境下是活跃的，且其活性与水稻的防御反应具有一定关系。

植物反转录转座子的RT序列，无论是Ty1－copia类还是Ty3－gypsy类，都存在很大的异质性。水稻反转录转座子的RT基因序列也有很大异质性，Wang等(1997)报道水稻中反转录酶差异达1%～64%。然而本研究中具活性的RT基因序列亲缘关系却较近，大部分同源性在90%以上。与基因组中反转录转座子的RT序列相比，具有转录活性的RT序列的异质性较低，这种特征在其他植物中也有类似报道。

虽然逆境压力条件不同，但大部分被激活转录的gypsy类反转录转座子的RT序列同源性很高，且不同逆境诱导形成的序列分布形成交叉。不同压力激活相似的RT序列也曾在草莓上有相似的报道，但并未解析其机理。植物在长期的进化过程中可能形成了复杂的防御和抗性机制，反转录转座子的激活表达可能与植物与水稻的防御反应具有一定联系。我们推测不同逆境处理能使水稻产生某些相似的胁迫信号分子，从而激活了相似的反转录转座子家族，也说明水稻在受到不同逆境胁迫下可能共享了一部分信号通路，逆境信号途径间存在网络交叉关系。

我们的结果将为进一步研究水稻中反转录转座子在逆境胁迫下的功能与作用机制提供参考。关于反转录转座子在基因组中的意义，将会随着更多基因组序列的分析和相关遗传功能的研究，得到越来越清晰的阐明。

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