水稻染色体组多倍化：同源四倍体双胚苗发育特征

同源四倍体双胚苗水稻雌配子体的发育特征⁽¹⁾

黄群策　代西梅　贾宏汝

摘要　利用激光扫描共聚焦显微技术对3份水稻材料的雌配子或雌配子体的发育特征进行了观察鉴定。研究结果表明，在所有的试验材料中都存在着两种雌配子体的发育现象，即在正常的发育过程中和在异常的发育过程中各种试验材料均表现出一定的特异性。对于正常的发育过程而言，所有的试验材料均表现出明显的相似性。在两份同源四倍体水稻品系中，双胚苗品系ASDOR05－01比其亲本99－01₍₄₎表现出更加明显的特异性。成熟胚囊的结构状态与其育性表现存在着一定的相关性。经过离子束注入处理后所筛选到的双胚苗水稻材料在生殖发育特性上表现出更加明显的特异性，即表现出更弱的有性生殖能力。

关键词　同源四倍体双胚苗水稻;雌配子体;发育特征

在农作物遗传改良的研究领域内最引人瞩目的成就首推育种家利用特定的技术程序完成了“三系”配套或“两系”配套，进而巧妙地利用生物体杂种优势效应挖掘农作物的产量潜力。基于在利用生物体杂种优势过程中杂交种子生产程序的复杂性，一些研究者很早就提出利用无融合生殖方式固定其杂种优势效应^［1］。根据禾本科植物内具有无融合生殖特性物种的形态学特征，多胚苗现象与无融合生殖特性呈现出明显的正相关性^［2］。在2000年之前，水稻无融合生殖的研究主要立足于在二倍体水平寻找在形态上具有多胚苗特征或在胚胎学上具有多胚特性的新的种质资源，而近年来在多倍体水平寻找水稻无融合生殖种质则已经成为新的研究方向^［3］。

利用离子束生物技术在同源四倍体水稻中创造新的种质资源的实用性已经被大量的研究结果所证实^［4，5］。通过氮离子束辐照之后我们在同源四倍体水稻的后代群体内曾筛选到具有双胚苗特征的突变单株^［6］。经过多代纯化和筛选之后已经获得了稳定的株系。在此基础上，对其雌配子或雌配子体的发育动态值得进行深入的研究。本试验借助于激光扫描共聚焦显微技术对试验材料的雌配子或雌配子体的发育过程和发育特征进行了观察鉴定，旨在研究其发育特征，为正确评价其实用价值和学术价值提供依据。

1　材料与方法

在试验中所采用的试验材料是具有双胚苗特征的同源四倍体水稻株系ASDOR05－01。同时，以相应的两份亲本材料［即同源四倍体水稻品系99－01₍₄₎和相应的二倍体水稻品系99－01₍₂₎］作为对照。在两份亲本材料中，99－01₍₄₎是以二倍体水稻品系99－01₍₂₎作为亲本材料，通过种芽诱导法进行染色体组加倍后所筛选到的主要农艺性状已经达到稳定状态的同源四倍体水稻品系^［7］。ASDOR05－01是以99－01₍₄₎为亲本材料，经过氮离子束辐照之后，在其后代群体内所筛选得到突变单株，随后再按照系谱法经过多代筛选和纯化之后所获得的具有双胚苗特征的稳定株系^［8］。

在试验中采用细胞核荧光染色技术和子房整体透明技术对试验材料进行前处理。根据水稻的生育特性，在试验材料处于胚囊发育的8个时期分别取位于幼穗中部的颖花为试验材料，将其固定于FAA固定液中。在胚囊发育的每个时期获取100个颖花作为试验材料。在开始试验之前，首先利用70%的酒精将颖花冲洗一下，然后在解剖镜下从中分离出子房，将其保存在70%酒精中备用。在对试验材料进行染色之前，各个时期的子房材料分别经过浓度为50%、30%、15%的乙醇浸泡后将其放入蒸馏水中，乙醇浸泡的每一次梯度时间为20min。接着，在温度为60℃的水浴锅内利用1mol/L的HCl对试验材料水解15min。再利用1%的曙红Y对试验材料衬染8h。加入蒸馏水进行冲洗，换洗数次至无浮色为止。

过后，利用柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液(0.1mol/L，pH = 5.0)对试验材料预处理8h，在温度为25℃的黑暗条件下利用20 μg/mLh33342(Hoechest stain)对其进行染色24h。利用蒸馏水对试验材料冲洗2～3次，利用乙醇梯度(15%、30%、50%、70%、85%、95%)进行脱水，每一级的脱水时间为20min。随后，将子房放入无水乙醇中脱水两次，每次脱水的时间为2h，再将其转入无水乙醇中过夜。第2天将已经脱水的材料放入由无水乙醇和水杨酸甲酯(1∶1)组成的混合液中过渡1h，再用水杨酸甲酯透明处理3次。在前两次透明处理中每次处理的时间为2h，最后一次透明处理的时间为15h。试验材料经过水杨酸甲酯透明处理后可以在水杨酸甲酯中保存备用。在对试验材料进行观察之前，用镊子轻轻将处理好的子房夹出，将其置于凹玻片上，利用丁香油进行封片处理。将制备好的载玻片倒置于Leica SP2激光扫描共聚焦显微镜上，利用波长为488nm的激发光对试验材料进行激发处理，通过激光扫描后可以获得胚囊各个发育时期的清晰图片。通过对图像资料进行分析、比较和综合之后确定试验材料在胚囊发育的各个时期所表现的特异性。

对3份试验材料的雌配子体的育性与其结实率的相关性进行了比较研究。在田间条件下按照顺序排列方式进行单株种植，每份试验材料的群体为200株，采用常规的田间管理措施。在试验材料始穗后30 d从每份试验材料的群体内随机地取10株材料进行考种。通过对考种结果进行比较分析后确定其结实率特点以及试验材料的育性与其结实率的相关性。

2　结果与分析

2.1　试验材料正常雌配子体的发育特征

根据前人的研究结果，水稻雌配子体的正常发育过程有其特点。在本试验的观察鉴定中已经确定，在所有试验材料中都存在着两种雌配子体的发育现象，即在正常的发育过程中和在异常的发育过程中均表现出一定的特异性。对于正常的发育过程而言，所有的试验材料均表现出明显的相似性。

在孢原母细胞形成期，在珠心组织的表皮下会分化出形态上具有一定特征的孢原细胞，即孢原细胞在形态上呈近圆形，体积比较大，细胞质比较浓厚，细胞核比较明显，在细胞核内具有一个染色比较深的核仁。在大孢子母细胞形成期，随着内珠被细胞和外珠被细胞不断伸长的同时，孢原细胞也明显地伸长和增大，由此分化出大孢子母细胞。大孢子母细胞的细胞核和核仁比较明显，在其细胞核内存在着染色比较深的染色质。在此时，胚珠逐渐发生倒转生长。在大孢子母细胞减数分裂期，大孢子母经过第一次分裂后形成二分体。二分体经过第二次分裂后形成四分体。在功能大孢子形成期，在四分体中靠近珠孔端的3个大孢子依次发生退化，即珠孔端的大孢子最先退化，然后是靠珠孔端的第2个和第3个大孢子相继发生退化，最后只有近合点端的大孢子经过发育后形成功能性大孢子。在单核胚囊形成期，功能大孢子的体积逐渐增大，在细胞内开始出现液泡，其细胞核偏向于珠孔端。在胚囊有丝分裂期，在单核胚囊内的细胞核经过1次有丝分裂后形成两个无壁的细胞核。在细胞骨架系统的牵引下，无壁的细胞核分别移向胚囊的珠孔端和合点端，由此形成2核型胚囊。在此时，在胚囊中间存在着一个比较大的液泡。在2核胚囊内，位于珠孔端和合点端的细胞核分别发生2次连续分裂，由此分别形成4核胚囊和8核胚囊。在正常情况下，胚囊内的有丝分裂会同步进行，即由单核胚囊发生分裂后会分别形成2核胚囊、4核胚囊和8核胚囊。在8核胚囊发育期，首先由珠孔端和合点端的1个细胞核发生位移，即分别移向胚囊的中部，由此形成中央细胞的2个极核。在此时，胚囊内的各个细胞核逐渐地发生细胞化，即在合点端的3个细胞核分别发育为3个反足细胞;在珠孔端的3个细胞核分别发育为1个卵细胞和2个助细胞。在成熟胚囊期，在卵器中的1个助细胞已经发生退化，在成熟胚囊内往往只能见到1个助细胞。助细胞的细胞核比较小，具有1个比较小的核仁。在助细胞的珠孔端存在着具有特异性的丝状器。卵细胞呈梨形，位于珠孔端部分比较小而位于合点端部分比较大。其细胞核往往位于近珠孔端，其中有1个比较大的、染色比较深的核仁。在卵细胞的合点端内存在着1个大的液泡。在成熟胚囊中，卵细胞的细胞质一般比较稀薄，在发生受精作用之前，仅仅在其细胞核的外围形成比较浓厚的细胞质。中央细胞为1个高度液泡化的细胞，其形状比较大。2个极核紧靠在一起，在每1个极核内各存在着1个比较大的核仁。2个极核在发生受精作用之前并不会融合成次生极核。反足细胞位于胚囊内的合点端，在发生受精作用之前反足细胞通过分裂后已经增殖为多个细胞，在每个细胞内往往存在着多个形态上不规则的细胞核。反足细胞的染色质浓厚，染色往往比较深。

2.2　试验材料雌配子体发育过程中的异常现象

前人的研究结果已经证实，通过染色体组多倍化使二倍体生物成为多倍体生物之后，两者在生殖发育特性上会产生明显的差异^［2，9］。在本试验的观察鉴定中发现，在雌配子体发育过程中同源四倍体水稻品系比相应的二倍体水稻品系出现异常胚囊的比例更大。在两份同源四倍体水稻品系中，双胚苗品系ASDOR05－01比其亲本99－01₍₄₎表现出更加明显的特异性。

在ASDOR05－01植株的雌配子体发育过程中，其特异性主要包括11种类型。其一是在减数分裂Ⅱ期间发生子细胞分裂不同步现象。在二分体时期，当位于近珠孔端的一个子细胞已经进入分裂后期，而近合点端的一个子细胞仍然没有启动新的细胞分裂。其二是在四分体时期，四个子细胞全部发生退化，以至于胚珠内只剩下一个空腔而不存在胚囊结构。其三是在胚囊内发生有丝分裂的过程中，细胞核的数目及其分布出现异常。在观察中发现，在1个胚囊内存在着6个细胞核，其中珠孔端4个，合点端2个，并且在胚囊内所有细胞核几乎呈直线分布。其四是胚囊的构型异常。在有的胚珠内珠孔端外部有一列呈直线排列的细胞，由此将胚囊挤在很小的空间里。在胚囊的珠孔端无卵器结构，胚囊内只存在着3个反足细胞和2个极核。其五是在胚囊内极核数目或位置发生异常。在胚囊发育过程中，两个极核均发生退化，以至于在胚囊内没有极核存在;或者在中央细胞内1个极核发生退化，以至于在成熟胚囊内只存在着1个极核;在有些成熟胚囊内极核没有正常地移位至卵器的上端，而是位于胚囊的中央，或位于合点端，或靠近反足细胞团。其六是在胚囊内的卵器发生退化或卵器细胞出现异常。在胚囊内，有的卵器发生退化后在卵器的位置上不存在正常的细胞结构;在有的成熟胚囊中卵器内的两个助细胞全部退化，以至于在卵器内只存在着1个卵细胞。其七是雌性生殖单位发生退化。在有些胚囊内，卵器和极核均发生退化，以至于在胚囊内只能观察到反足细胞团。其八是胚囊在发育过程中逐渐发生解体，最终导致胚囊退化。其九是子房和胚囊细胞在发育过程中发生退化，试验材料经过染色后细胞壁显示出强烈的荧光。其十是在同一个胚珠内出现多卵卵器胚囊，这很可能是形成多胚的原因之一。其十一是出现双套胚囊现象。在观察中发现，在同一个胚珠内出现了双套胚囊现象，两个胚囊相对分布并且各有一套卵器，一个胚囊的卵器位于珠孔端，而另一个胚囊的卵器位于合点端。

在试验中通过对ASDOR05－01的98个成熟胚囊进行观察鉴定后确定，其中64个胚囊具有正常的胚囊结构，其正常胚囊的频率为65.31%;在34个胚囊内出现了退化现象或异常现象，其异常胚囊的频率为34.69%。

2.3　试验材料成熟胚囊的结构与其育性的关系

前人的研究结果已经证实，水稻的育性表现不但与其雄配子或雄配子体的发育状态有一定的相关性，还与其雌配子或雌配子体的发育状态有一定的相关性^［9－11］。本试验的研究结果表明，在所有试验材料中成熟胚囊的结构状态与其育性表现存在着一定的相关性。在二倍体水稻中正常胚囊所占的比率比较高，而异常胚囊的频率比较低，其结实率也比较高。同源四倍体水稻与二倍体水稻相比，前者的异常胚囊的频率明显增加，其结实率也显著下降。在两份同源四倍体水稻材料中，ASDOR05－01的异常胚囊的频率比较高，其结实率比较低(表1)。由此可见，经过离子束注入处理后所筛选到的双胚苗水稻材料在生殖发育特性上表现出更加明显的特异性，即表现出更弱的有性生殖能力。(www.chuimin.cn)

表1　成熟胚囊的类型与其结实率

3　讨论

利用离子束生物技术创造水稻新种质已经为同源四倍体水稻的遗传改良找到了新的突破口^［5］。在离子束生物工程的研究领域内，近期迫切需要研究的问题之一就是对经过离子束注入处理之后突变体材料的后效性及其表现特征进行深入研究，特别是从突变体材料的生殖发育特性方面研究其特异性。关于二倍体水稻和同源四倍体水稻的生殖发育特性，前人已经进行过一些研究^{［12，13］}。然而，关于利用离子束注入技术所获的具有双胚苗特征的同源四倍体水稻的生殖发育特性，目前尚未见到公开的文献报道。本试验利用激光扫描共聚焦显微技术对同源四倍体水稻双胚苗材料及其对照的雌配子或雌配子体的发育特征进行了观察鉴定，由此对其发育的特异性进行了比较分析。研究结果表明，在所有的试验材料中都存在着两种雌配子体的发育现象，即在正常的发育过程中和在异常的发育过程中各种试验材料均表现出一定的特异性。

参考文献

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【注释】

(1)该文曾在《河南农业科学》 ［2007，35(4):18～21］刊出