生物化学实验：测定枯草杆菌蛋白酶活力

2023-11-04 理论教育版权反馈

【摘要】：实验类型综合性教学时数 6一、实验目的学习测定蛋白酶活力的方法，掌握分光光度计的原理和使用方法。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。蛋白酶活力单位定义：在30℃，pH7.5的条件下，反应8min，以每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1U。

实验类型综合性

教学时数 6

一、实验目的

学习测定蛋白酶活力的方法，掌握分光光度计的原理和使用方法。

二、实验原理

胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。

所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。

用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。

蛋白酶活力单位定义：在30℃，pH7.5的条件下，反应8min，以每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸为1U。

三、实验仪器与试剂

1.仪器

试管、吸管、漏斗、恒温水浴、722型分光光度计等。

2.试剂

标准酪氨酸溶液（100μg/mL）、碳酸钠溶液（0.55mol/L）、酚试剂、酶液、10%三氯乙酸。

四、实验内容

1.绘制标准曲线(www.chuimin.cn)

取试管7支，编号，按下表加入试剂。

摇匀，置30℃恒温水溶液中显色15min。用分光光度计测定680nm的光吸引值。以光吸引值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.酶活力测定

取酶液1mL，在30℃预热5min，吸取0.5%酪蛋白溶液2mL置于试管中，在30℃水浴中预热5min后加入的酶液0.5mL，立即计时，反应 8min后，由水浴取出，立即加入 10%三氯乙酸溶液 3mL放置 15min，用滤纸过滤。

同时另作一对照管，即取酶液0.5mL先加入3mL 10%的三氯乙酸溶液。摇匀，然后再加入0.5%酪蛋白溶液2mL，30℃保温8min，放置15min，过滤。

取3支试管，编号，分别加入样品滤液、对照滤液和蒸馏水各1mL，然后各加入0.55mol/L的碳酸钠溶液5mL混匀后再各加入酚试剂1mL，立即混匀，在30℃显色15min。以加入的一管作空白，在680nm处测对照及样品的吸光度值。

五、实验结果与计算

1g枯草杆菌蛋白酶在30℃，pH7.5的条件下所具有的活力单位为：

式中 A_样品——样品液的吸光度值；

A_对照——对照液的吸光度值；

K——标准曲线上A=1时对应的酪氨酸的量，μg；

V——酶促反应液的体积，mL；

T——酶促反应时间，min；

N——酶溶液稀释倍数。